D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Chanpiyon fitopatogenik Colletotrichum coccodes la lakòz maladi danjere nan pòmdetè ak tomat ke yo rekonèt kòm anthracnose ak tubèrkul tach nwa. Pa karakteristik mòfolojik, yo souvan difisil yo distenge soti nan maladi ki te koze pa lòt mikwo-òganis; sou fwi tomat vèt, maladi a ka san sentòm, manifeste poukont li sèlman sou fwi mi wouj. Pou dyagnostik rapid ak egzat nan patojèn lan, yo ofri yon sistèm tès PCR an tan reyèl. Pou devlope yon sistèm tès, yo te detèmine sekans nukleotid jèn deidrojenaz gliferol trifosfat la nan 45 tansyon coccodes izole nan tubèrkul pòmdetè nan diferan rejyon nan Larisi.
Ki baze sou rezilta yo jwenn ak analiz la nan sekans menm jan an nan lòt espès ki disponib nan baz done a GenBank, espès-espesifik primè ak pwofonde pou C. coccodes yo te fèt. Pou tcheke espesifik nan sistèm tès la kreye, PCR te pote soti ak ADN izole nan kilti pi nan 15 espès diferan nan fongis parazit ak saprotwof ki asosye ak plant tomat ak pòmdetè (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Prezans nan Colletotrichum coccodes ADN te detèmine nan yon sik papòt nan 20-27, pandan ke lòt espès yo te detekte apre 40 sik oswa yo pa te detekte. Sistèm tès la fè li posib pou detekte fyab C. coccodes konsantrasyon ADN ki depase 0.01 ng / mm3 nan melanj PCR analize a. Sèvi ak sistèm tès la devlope, prezans nan C. coccodes nan fèy tomat ak sentòm maladi chanpiyon ak nan tubèrkul pòmdetè san yo pa sentòm ekstèn nan maladi a te envestige. Fèy ak sentòm enfeksyon chanpiyon yo te ranmase nan de jaden diferan nan rejyon Krasnodar, tubèrkul - soti nan jaden nan rejyon Kostroma, Moskou, Kaluga, Nizhny Novgorod. Yon fèy tomat ki gen C. coccodes ADN te jwenn nan Teritwa Krasnodar; yon prezans siyifikatif nan ADN nan patojèn sa a te detekte nan 5 echantiyon nan tubèrkul grandi nan rejyon yo Kostroma, Moskou, Kaluga.
Entwodiksyon
Chanpiyon nan genus Colletotrichum yo se fitopatogen danjere ki afekte sereyal, legim, remèd fèy, fwi kontinuèl ak plant Berry. Youn nan espès yo omniprésente nan sa a genus, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, se ajan ki lakòz anthracnose ak tach nwa nan pòmdetè ak tomat, ak lakòz maladi nan yon kantite lòt plant nan fanmi an Solanaceae, incl. move zèb (Dillard, 1992). C. coccodes enfekte tout pati anba tè plant lan, baz tij, fèy, ak fwi (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Sou kale tubèrkul pòmdetè ki enfekte yo, yo obsève devlopman tach gri ak bor endistans pwononse, sou ki pwen nwa nan sporulation ak mikrosklerotya vizib klèman. Pandan depo, ilsè ak sa ki adousi ka fòme nan kaka tubèrkul yo, i.e. maladi a antre nan faz la anthracnose, ki, sepandan, se bagay ki ra anpil.
An menm tan an, sentòm yo nan anthracnose (maladi ilsè po ak ti pwen nwa) yo tipik sou fwi tomat. Sou fèy yo, sentòm C. coccodes yo parèt tankou tach nwa mawon, anjeneral entoure pa tisi jòn (Johnson, 1994).
Devlopman nan tach nwa sou tubèrkul yo gate aparans yo, ki se espesyalman pwononse lè vann lave wouj pòmdetè kale. Peeling èksfolyasyon mennen nan evaporasyon depase ak ogmante pèt depo (grangou ak McIntyre, 1979). Domaj nan lòt ògàn plant mennen nan pèt sede, ki te note nan tou de louvri ak fèmen tè (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Maladi ki koze pa C. coccodes yo komen nan prèske tout rejyon ki pwodui pòmdetè nan mond lan, ki gen ladan Larisi (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontwòl maladi sa yo difisil akòz efikasite ensifizan fonjisid ki egziste deja kont C. coccodes ak mank de varyete rezistan (Li, Kache, 1995).
C. coccodes inoculum la ka pèsiste nan tubèrkul grenn (Li, Kache, 1988; Johnson et al., 1997), grenn tomat (Ben-Daniel et al., 2010), siviv pou yon tan long nan tè, sou debri plant (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) ak nan move zèb (rèd, Pennypacker, 1987). Travay yo nan yon kantite otè (Li, Kache, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) yo te montre ke devlopman nan maladi a nan pòmdetè ak tomat lajman depann sou prezans nan inoculum nan grenn ak tè. Se poutèt sa, pou misyon pou minimize pèt soti nan maladi a, li nesesè fè dyagnostik (ki gen ladan quantitative) propagul yo nan chanpiyon an nan materyèl la pitit pitit, nan tè a, nan tubèrkul yo pòmdetè pitit pitit ak grenn tomat mete pou depo. Diagnostik mòfolojik nan tè ak materyèl plant yo ka te pote soti sèlman nan prezans mikrosklerotya, ki, sepandan, yo jwenn tou nan lòt kalite fongis.
Sentòm yo sou tubèrkul yo sanble anpil ak goute an ajan ki te koze pa chanpiyon Helminthosporium solani la. Izolasyon nan coccodes Colletotrichum ak Helminthosporium solani nan yon kilti pi se pito difisil e li pran yon tan long akòz kwasans lan dousman sou yon mwayen eleman nitritif. Pou byen vit idantifye Colletotrichum coccodes, li nesesè pou itilize metòd enstrimantal dyagnostik. Metòd ki pi pratik la se reyaksyon chèn polymérase (PCR) ak modifikasyon li yo - an tan reyèl PCR. Kounye a, yon sistèm tès devlope pa chèchè Britanik (Cullen et al., 2002) pou rejyon ITS1 nan rDNA yo itilize nan Ewòp ak Etazini yo. Itilizasyon li te montre bon rezilta nan analiz izole Ris yo (Belov et al, 2018). Sepandan, C. coccodes trè varyab ak deteksyon li yo nan yon sekans ADN sèl ka mennen nan fo rezilta negatif. Pou yon dyagnostik ki pi serye, analiz obligatwa pou plizyè sekans ADN espès-espesifik, an koneksyon avèk ki nou devlope yon sistèm tès orijinal ki pèmèt idantifye C. coccodes pa sekans jèn glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase la.
Materyèl ak metòd
Pou evalye efikasite ak espesifik nan sistèm tès yo kreye, nou itilize kilti pi nan 15 espès fongis izole pa otè yo soti nan echantiyon malad nan fèy tomat ak fwi, tubèrkul pòmdetè (Tablo 1). Pou izolasyon, nou te pran ògàn nan plant ki gen sentòm enfeksyon chanpiyon, pa plis pase yon sèl ògàn pou chak ti touf bwa.
Yon tranch nan yon tubèrkul ak yon kale, yon tranch nan yon fwi tomat, ak yon fèy ki afekte yo te mete anba yon mikwoskòp binokilè, apre yo fin ki miselyom, espò, oswa yon moso nan tisi yo te transfere nan yon mwayen agar (wort agar) nan yon plat Petri ak yon zegwi sèk file. Izole yo te estoke sou pant agar nan tib tès nan 4 ° C.
Echantiyon nan fèy tomat ak sentòm maladi chanpiyon, gen entansyon pou analiz, imedyatman apre koleksyon (nan jaden an) yo te mete nan 70% alkòl etilik kote yo te estoke jiskaske izolasyon ADN. Tubèrkul pòmdetè yo te delivre nan laboratwa a, kale (2 × 1 cm moso) nan men yo, ak nan frizè nan -20 ° С. Estoke nan frizè jouk izolasyon ADN.
Kilti pi nan fongis pou izolasyon ADN yo te grandi nan mwayen pwa likid. Miselyom nan chanpiyon an te retire nan mwayen likid la, cheche sou papye filtre, nan frizè nan nitwojèn likid, omojeneize, enkubate nan tanpon CTAB, pirifye ak klowoform, presipite ak yon melanj de isopropanol ak 0.5 M asetat potasyòm, lave de fwa ak 2% alkòl. ADN ki kapab lakòz la te fonn nan dlo deyonize epi estoke nan –70 ° С (Kutuzova et al., 20). ADN konsantrasyon te mezire lè l sèvi avèk yon twous HS quantification ADN pou ADN doub bloke sou Qubit 2017 (Qiagen, Almay). Echantiyon yo alkòlize ak jele yo te triturated nan nitwojèn likid, Lè sa a, fè ekstraksyon ADN te pote soti jan sa dekri anwo a (pou miselyom la nan kilti pi bon chanpiyon).
Tablo 1. Orijin nan tansyon yo fongis itilize
Non djondjon | Plant, ògàn | Kote seleksyon an |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | tubèrkul pòmdetè | Rejyon Kostroma, tubèrkul pòmdetè nan jenerasyon an jaden 1st, cultivar wouj Scarlett |
Colletotrichum cocodes 4 | fèy pòmdetè | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | tubèrkul pòmdetè | Rejyon Magadan, pos. Tant, tubèrkul pòmdetè |
Cladosporium fulvum | fèy tomat | Moskou rejyon an, gwo-frwi tomat |
Alternaria Tomatophila | fwi tomat | soumèt pa anplwaye nan laboratwa a nan mikoloji ak fitopatoloji nan Enstiti a Rechèch tout-Ris nan Pwoteksyon Plant |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | fwi tomat | Krasnodar Teritwa, Krymsky distri, klas krèm |
Fusarium oxysporum | rasin ble | Moskou rejyon an |
PCR te pote soti sou yon anplifikatè DTprime (ADN-Teknoloji). Pou PCR, primè orijinal yo ak yon pwofonde pou rejyon espès-espesifik nan jèn gliserol trifosfat dehydrogenase yo te itilize: pi devan Jadendanfan Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, ranvèse Jadendanfan Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Jadendanfan yo anplifye yon rejyon 213 bp.
Reyaksyon an te pran 50 ng nan ADN total (nan analiz la nan fèy ak tubèrkul) ak 10 ng (nan analiz la nan ADN nan kilti pi bon kalite nan fongis). Melanj reyaksyon an (35 μl) te separe pa yon kouch parafin nan de pati: yon sèl ki pi ba (20 μl) genyen 2 μl nan 10 × tanpon reyaksyon (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM nan chak trifosfat deoksinukleotid, 7 pmol nan chak Jadendanfan, ak 4 pmol nan yon pwofonde fliyoresan idrolizabl; yon sèl anwo a genyen 1 μl nan 10 × tanpon PCR ak 1 U nan polimeraz Taq.
Separasyon nan melanj la ak parafin pèmèt tib yo dwe estoke pou yon tan long nan yon tanperati ki nan 5 ° C ak bay yon kòmanse cho pou PCR apre chofaj yo pou 10 minit nan yon tanperati ki pi wo a 80 ° C. PCR te fèt selon pwogram sa a: 94.0 ° C - 90 s (1 sik); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 sik); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 sik); 10.0 ° C - depo.
Rezilta ak diskisyon
Sekans jèn glycerol triphosphate dehydrogenase yo te detèmine nan 45 tansyon izole nan fèy, tij, tubèrkul pòmdetè, ak fwi tomat (Kutuzova, 2018) nan diferan rejyon nan Larisi. Sekans yo etidye nan tout tansyon yo te divize an 2 gwoup diferan nan de nukleotid. Sekans nikleyotid reprezantan tou de gwoup yo anba nimewo KY496634 ak KY496635 yo depoze nan GenBank.
Jadendanfan coc70gdf, coc280gdr ak sond cocgdz ki fèt sou baz yo te tcheke avèk pwogram BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) sou tout sekans glycerol triphosphate dehydrogenase jèn espès nan genus Colletotrichum ak lòt òganis ki disponib nan baz done GenBank la.
Yo pa jwenn okenn rejyon ADN nan lòt òganis ki trè omolog nan primè ak pwofonde.
Sansiblite nan sistèm tès la te tcheke lè l sèvi avèk echantiyon ak konsantrasyon diferan nan C. coccodes ADN, ADN ki sòti nan yon fèy pòmdetè enfekte ak anthracnose (kolekte nan 2017 nan Mari El, varyete Wouj Scarlett), ak kale nan tubèrkul ki afekte nan tach nwa (kolekte nan rejyon Kostroma, varyete Wouj Scarlett, Table 2). Pou konfime prezans ADN nan tubèrkul ak fèy pòmdetè, tansyon C. coccodes yo te izole nan yo nan kilti pi.
Rezilta analiz sansiblite sistèm tès la montre ke li ka itilize pou fè dyagnostik avèk siksè prezans C. coccodes ADN nan yon echantiyon lè kontni total li nan melanj PCR la plis pase 0.05 ng. Sa a se ase ase pou deteksyon, depi yon sèl sclerotia gen an mwayèn 0.131 ng, ak yon sèl spor gen sou 0.04 ng nan ADN (Cullen et al., 2002). Sistèm tès la devlope pa gwoup angle a (Cullen et al., 2002) te montre yon sansiblite menm jan an (sik papòt 34 nan 0.05 ng ADN ak 37 nan 0.005 ng).
Analiz de echantiyon natirèl ki gen C. coccodes nan tout ka fè li posib pou revele fiable prezans li nan echantiyon an (Tablo 2). Metòd yo pwopoze a pou izolasyon ADN te aplikab tou pou analiz echantiyon plant natirèl yo.
Tablo 2. Detèminasyon de sansiblite nan sistèm tès yo pwopoze a pou idantifikasyon an nan coccodes Colletotrichum pou an tan reyèl PCR
Anrejistreman | Kantite ADN ki nan echantiyon an *, ng | Limit sik | C. deteksyon coccodes |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Peye tubèrkul 1 | 50 | 32 | + |
Peye tubèrkul 2 | 50 | 30 | + |
Peye tubèrkul 3 | 50 | 31.5 | + |
Fèy pòmdetè | 50 | 29.5 | + |
Remak. * Nan yon melanj de pwodwi PCR.
Espesifik nan sistèm tès la te teste sou echantiyon ADN ekstrè soti nan 15 espès fongis. Tout tansyon nan fongis yo te izole pa otè yo soti nan fwi ki afekte ak sante ak fèy nan tomat, tubèrkul pòmdetè; yon sèl souch te izole nan rasin ble (Tablo 1). Pami espès yo izole nan sifas fwi a, genyen tou espès ki pa patojèn pou tomat (pa egzanp, Phellinus ferrugineovelutinus).
Etid yo montre ke C. coccodes ADN te detekte nan yon sik papòt nan 20-27, pandan ke lòt espès chanpiyon yo pa te detekte oswa bay yon siyal apre sik 40, ki ka dwe atribiye a yon efè bri nonspecific (Table 3).
Tablo 3. Tcheke sistèm tès la pou divès kalite dyondyon
Non djondjon | Limit sik |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. kokodes 2 | 22.6 |
C. kokodes 3 | 23 |
C. kokodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. vètikal | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. Tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria krassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Remak. * Kantite ADN nan tout echantiyon yo te 10 ng.
Yo te itilize sistèm tès devlope a pou idantifye C. coccodes nan echantiyon fèy tomat ki gen sentòm patojèn nekrotwofik ak tubèrkul pòmdetè grenn san sentòm vizib. Pou etid la, nou te pran tubèrkul grenn nan diferan varyete grandi nan rejyon Kostroma, Moskou, Kaluga, Nizhny Novgorod. Prezans nan C. coccodes ADN te konsidere kòm siyifikatif nan echantiyon yo, nan analiz la ki sik papòt la pa t 'depase 35. Valè papòt sa a te chwazi ki baze sou detèminasyon serye nan 0.05 ng nan C. coccodes ADN (papòt sik 33.5, Tablo 2) ak lefèt ke sik papòt ki pi wo a 40, ADN ki pa espesifik nan kèk lòt espès fongis yo te dyagnostike. Avèk apwòch sa a, yo te detekte prezans siyifikatif nan ADN coccodes nan 5 echantiyon tubèrkul grandi nan rejyon Kostroma, Moskou, Kaluga ak nan yon sèl fèy tomat nan distri Yeisk nan rejyon Krasnodar (Tablo 4, 5).
Tablo 4. Deteksyon coccodes Colletotrichum sou tubèrkul pòmdetè *
Nimewo echantiyon | Varyete pòmdetè | Kote kwasans lan | C. deteksyon coccodes | Limit sik |
---|---|---|---|---|
1 | Wouj wouj | Kostroma rejyon an | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskou rejyon an | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky byen bonè | Moskou rejyon an | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga rejyon an | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasy | Kaluga rejyon an | - | |
15 | Gala | Rejyon Nizhny Novgorod | - | |
16 | - |
Remak. * Kantite ADN nan tout echantiyon yo te 50 ng.
Tablo 5. Deteksyon coccodes Colletotrichum sou fèy tomat *
Nimewo echantiyon | Kote kwasans lan | C. deteksyon coccodes | Limit sik |
---|---|---|---|
1 | Teritwa Krasnodar, Distri Crimean | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Teritwa Krasnodar, Distri Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Kantite ADN nan tout echantiyon yo te 50 ng.
Sistèm tès la kreye pa nou an pa enferyè a sa devlope pa chèchè Britanik yo (Cullen et al., 2002) nan sansiblite ak espesifik ak apwopriye pou analiz echantiyon plant yo. Aplikasyon li pou analiz la nan tubèrkul pitit pitit te fè li posib yo idantifye C. coccodes ADN nan tubèrkul san yo pa siy ekstèn nan domaj ak avèk siksè analize enfeksyon an nan fèy yo.
Dat, pa gen okenn analiz de tubèrkul pòmdetè pou enfeksyon an nan C. coccodes te pote soti nan Larisi. Premye etid nou an te montre ke soti nan 16 tubèrkul grenn teste grandi nan diferan rejyon nan Federasyon Larisi la, 5 gen C. coccodes. Sa a montre ke tach nwa nan tubèrkul pòmdetè se yon maladi pòmdetè komen nan Larisi, ak wòl li nan diminye volim ak bon jan kalite a nan rekòt la pòmdetè souzèstime.
Analiz fèy tomat devwale yon prezans siyifikatif nan ADN coccodes nan yon sèl fèy nan Distri Yeisk nan Krasnodar Teritwa. Byen bonè, lè w ap ekzamine jaden tomat nan sid Larisi lè l sèvi avèk sistèm tès Britanik lan (Cullen et al., 2002), fèy ki gen C. coccodes yo te jwenn, ak nan kèk jaden yo te jwenn yon gwo pwopòsyon nan fèy ki enfekte ak C. coccodes (Belov et al., 2018). Nan teritwa Krasnodar ak Primorsky yo, rejyon Moskou a, nou jwenn fwi tomat, kote nou jere izole kilti pi bon kalite C. coccodes. Li posib ke C. coccodes se pi plis toupatou sou tomat nan Larisi pase sa yo kwè kounye a, ak danjere li yo tou souzèstime.
Se konsa, nan dat, ase enfòmasyon ki te akimile sou distribisyon an toupatou nan C. coccodes sou pòmdetè ak tomat.
Pou pi byen konprann wòl chanpiyon sa a nan devlopman maladi pòmdetè ak tomat, anpil siveyans prévalans li nan Larisi, etid sou wòl tè ak enfeksyon pitit pitit, ak wòl tach nwa nan pèt pandan depo yo mande yo. Itilize nan PCR dyagnostik ka siyifikativman fasilite travay sa a, ak itilize nan similtane nan tou de sistèm tès yo pral siyifikativman ogmante presizyon nan analiz la.
Travay sa a te sipòte pa yon sibvansyon ki soti nan Ris Syans Fondasyon No 18-76-00009 la.
Atik la te pibliye nan jounal "Mikoloji ak fitopatoloji" (volim 54, nimewo 1, 2020).